ПЦР имитирует естественный процесс репликации (размножения) ДНК, в результате чего, в течение нескольких часов из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах.
ПЦР нашла широкое применение не только в медицине (генетике, диагностике инфекционных, онкологических заболеваний, при определении отцовства и др.), но и в таких областях, как археология, судебная экспертиза.
Достоинства метода ПЦР:
1. Среди методов диагностики инфекционных возбудителей, ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности (за счет экспоненциального накопления фрагментов ДНК) и специфичности (за счет выявления уникальных для микро-(макро)-организмов участков генетического материала).
Аналитическая чувствительность ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий — 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала.
2. Выявление наличия инфекции на ранних стадиях инфицированности, до проявления клинических симптомов заболевания.
3. Возможность использования разнообразного клинического материала.
4. Возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования.
5. Простые требования к условиям хранения и транспортировки материала от пациента в лабораторию. Повышена стабильность при транспортировке до лаборатории, поскольку нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде, в отличие от бактериологических и вирусологических методов.
6. Скорость проведения анализа: время получения результатов, для некоторых инфекций меньше, чем 24 часа.
Метод ПЦР позволяет:
1. Определить этиологию инфекции (т.е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например, Mycoplasma genitallium, ПЦР – это единственный метод диагностики на сегодняшний день. В зависимости от ответа на данный вопрос вырабатывается тактика лечения.
2. Определить количество возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов (Gardnerella vaginalis и др.), которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).
3. Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.
При проведении ПЦР в режиме реального времени (Real Time) позволяет свести к минимуму риск контаминации и связанных с ней ложно-положительных результатов и артефактов ПЦР.
Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами (гонорея, трихомоноз, хламидийная инфекция). Например, при хронической гонорее у женщин даже с помощью бактериологического метода часто не удается выявить гонококк, несмотря на имеющиеся симптомы хронического воспалительного процесса в шейке матки или уретре.
ПЦР в диагностике гепатитов
В настоящее время известно как минимум 5 вирусов, способность которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. В редких случаях гепатит может быть вызван вирусом Эпштейна-Барр, вирусом простого герпеса. Способность поражать печень таких агентов как вирус ТТ, вирус гепатита G сегодня признается не всеми. Все вышеперечисленные вирусы относятся к различным семействам, имеют разные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита.
Учитывая вышеизложенное, весьма актуальной проблемой является адекватная этиологическая диагностика вирусных гепатитов, которая невозможна без использования современных молекулярно-биологических методов, одним из которых является ПЦР.
Итак, в чем же состоит достоинство ПЦР в диагностике гепатитов? Попробуем разобраться:
1. Вирусный гепатит А (ВГА): ПЦР используется для обследования контактных лиц и более раннего выявления заболевших гепатитом А в очагах инфекции (например, в детском коллективе), т.к. РНК вируса гепатита А появляется в крови больного гепатитом А гораздо раньше, чем антитела (anti-HAV IgM). И еще один важный момент! Считается, что через неделю после появления клинических симптомов, больной гепатитом А перестает быть заразным. Но это касается только фекально-орального пути передачи вируса. В крови больного гепатитом А вирус присутствует гораздо дольше (иногда до нескольких месяцев), т.е. возможность заражения гепатитом А через кровь не ограничивается вышеуказанными сроками, и ПЦР единственный метод, с помощью которого возможно осуществлять мониторинг вирусемии (наличия вируса в крови).
2. Вирусный гепатит В (ВГВ): в диагностике вирусного гепатита В ПЦР имеет свои неоценимые достоинства:
a. Качественное обнаружение ДНК ВГВ :
— Ранняя диагностика острого гепатита В – ДНК вируса гепатита В начинает обнаруживаться в крови больного гепатитом В в среднем на 20 дней раньше, чем HBsAg («Австралийский» антиген).
— Выявление мутантных штаммов вируса гепатита В.
— Выявление скрытых форм вирусного гепатита В.
b. Количественная оценка уровня ДНК HBV:
— Диагностика хронического гепатита В (вирусная нагрузка более 100000 является признаком хронического гепатита В).
— Мониторинг активности вирусной репликации у носителей HBsAg.
— Контроль эффективности противовирусной терапии.
c. Определение YMDD мутации (устойчивости вируса гепатита В к ламивудину) — в многочисленных исследованиях установлено, что у ряда пациентов, находящихся на монотерапии зефиксом (ламивудином), возможно появление мутантного штамма вируса, устойчивого к препарату, поэтому актуальной задачей является раннее выявление таких штаммов для коррекции схемы лечения.
3. Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:
a. Установить факт инфицированности гепатитом С. Во-первых, это важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК, и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.
b. Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС (при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС (генотип 1 хуже отвечает на противовирусную терапию по сравнению с генотипами 2 и 3).
c. Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так, наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.
d. Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.
ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции
В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход — обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) – anti-HIV с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ.
Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ.
С другой стороны, известно, что практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением.
Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес.
Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.
Обнаружение ВИЧ методом ПЦР в крови возможно в двух вариантах:
1. Обнаружение ДНК провируса ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови;
2. Обнаружение РНК ВИЧ в биологических жидкостях организма (например, в плазме или сыворотке крови).
Сейчас ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих случаях:
1. В период серологического »окна». Хотя следует помнить! что чувствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99%, в связи с чем, несмотря на высокие показатели чувствительности, ПЦР следует проводить или совместно с ИФА или с последующим подтверждением ИФА;
2. В случае сомнительного результата ИБ;
3. При обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Использование ПЦР в этом случае позволяет сократить сроки постановки диагноза ВИЧ-инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев.
ПЦР на РНК ВИЧ используется для количественного измерения концентрации вируса в крови с целью прогноза и мониторинга уже установленной ВИЧ-инфекции.
В заключение необходимо отметить, что уже на данном этапе развития ПЦР является самым чувствительным и специфичным методом прямого обнаружения возбудителей, позволяющим не только устанавливать этиологию заболевания, но и осуществлять контроль за течением инфекционного процесса и оценивать эффективность проводимой терапии. Учитывая все вышесказанное, становится очевидным, что полимеразная цепная реакция является необходимым и обязательным методом обследования пациентов, и должна находиться в арсенале каждого врача, занимающегося инфекционной патологией.
Информация предоставлена Медицинским центром здоровья (г.Харьков)
Медицинский центр здоровья единственный на Восточной Украине частный медицинский центр, имеющий в своем арсенале аппарат для постановки ПЦР в режиме «Real Time». Диагностическая лаборатория оснащена самым современным лабораторно-диагностическим оборудованием, в центре внедрены инновационные методики, компьютеризированная система обработки и хранения информации, для постановки анализов используются только оригинальные тест системы. Проводится диагностика эндокринных патологий, инфекционных заболеваний, иммунологического статуса организма, выявление онкологических заболеваний на ранних стадиях, бактериологическое исследование биоматериала, клинические и биохимические анализы.
Лаборатория соответствует всем стандартам Министерства Здравоохранения Украины
Медицинский центр здоровья активно сотрудничает с Центральными районными больницами Харьковской области, подключая свои отделения к единой IT-системе, что позволяет быстро и качественно проводить исследования, предоставлять точные результаты анализов «на места» в сжатые сроки. Приглашает к сотрудничеству прогрессивно мыслящих врачей:
Вы имеете возможность по телефону или через сайт (обратная связь) отправить заявку на проведение для Вас индивидуальной презентации оборудования и методики исследования по методу ПЦР.
