Cтатті
ПЛР. Чверть віковий ювілей геніального відкриття
26 Жов 2016
Виповнилося 25 років від дня відкриття полімеразної ланцюгової реакції (Polymerase chain reaction), більш відомої як "ПЛР» (PCR). Вона була відкрита Кері Б. Мюлліса в 1984 році, за що він був удостоєний Нобелівської премії. Це досягнення докорінно змінило зміст всієї молекулярної клінічної діагностики. І знаходить все нові застосування в нових областях.
У чому ж геніальність відкриття? Причина досить проста - ПЛР робить неможливе можливим. Часто її описують як метод, за допомогою якого вчені можуть знаходити голку в стозі сіна. »Голкою» є крихітний фрагмент генетичного матеріалу клітин, представлений у вигляді ДНК і РНК, які в свою чергу складаються з декількох мільярдів нуклеотідов. В сучасної лабораторної діагностики ПЛР займає особливе місце. Метод ПЛР підняв клінічну лабораторну діагностику на принципово іншу висоту, тому що рівень визначення нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), дозволяє провести пряме виявлення інфекційного агента або генетичної мутації в будь-який біотичної або абиотической середовищі. При цьому способом ПЛР, теоретично, може бути виявлена лише одна шукана молекула нуклеїнових кислот серед мільйонів інших молекул.
ПЛР імітує природний процес реплікації (розмноження) ДНК, в результаті чого, протягом декількох годин з одного фрагмента молекули ДНК можна отримати більше 50 млрд. Ідентичних молекул. Таким чином, можна вивчити генетичний матеріал, присутній в крихітних кількостях.
ПЛР знайшла широке застосування не тільки в медицині (генетиці, діагностиці інфекційних, онкологічних захворювань, при визначенні батьківства та ін.), Але і в таких областях, як археологія, судова експертиза.
Переваги методу ПЛР:
1. Серед методів діагностики інфекційних збудників, ПЛР володіє найбільш високими показниками чутливості (за рахунок експоненціального накопичення фрагментів ДНК) і специфічності (за рахунок виявлення унікальних для мікро- (макро) -організм ділянок генетичного матеріалу).
Аналітична чутливість ПЛР-тест-систем для більшості вірусів і бактерій - 1000 мікроорганізмів в 1 мл біологічного матеріалу.
2. Виявлення наявності інфекції на ранніх стадіях інфікування, до прояву клінічних симптомів захворювання.
3. Можливість використання різноманітного клінічного матеріалу.
4. Можливість одночасного виявлення декількох мікроорганізмів в одній біологічної пробі, на відміну від бактеріологічних методів, де для різних збудників використовуються різні способи культивування.
5. Прості вимоги до умов зберігання і транспортування матеріалу від пацієнта в лабораторію. Підвищена стабільність при транспортуванні до лабораторії, оскільки немає необхідності зберігати збудника в живому вигляді, на відміну від бактеріологічних і вірусологічних методів.
6. Швидкість проведення аналізу: час отримання результатів, для деяких інфекцій менше, ніж 24 години.
Метод ПЛР дозволяє:
1. Визначити етіологію інфекції (тобто який саме мікроорганізм або їх поєднання викликали запальний процес). Для деяких збудників, наприклад, Mycoplasma genitallium, ПЛР - це єдиний метод діагностики на сьогоднішній день. Залежно від відповіді на це питання виробляється тактика лікування.
2. Визначити кількість збудника. Особливо це актуально для умовно-патогенних мікроорганізмів (Gardnerella vaginalis та ін.), Які викликають патологію тільки за певних умов (наприклад, при підвищенні концентрації).
3. Здійснити контроль за перебігом інфекційного процесу і оцінити ефективність лікування. Однак необхідно враховувати той факт, що ПЛР може вловлювати навіть поодинокі фрагменти ДНК, які можуть залишатися деякий час після лікування, в зв'язку з чим, контроль ефективності проведеної терапії рекомендується проводити не раніше ніж через 2-3 тижні після її закінчення.
При проведенні ПЛР в режимі реального часу (Real Time) дозволяє звести до мінімуму ризик контамінації та пов'язаних з нею помилково-позитивних результатів і артефактів ПЛР.
Завдяки своїй високій чутливості, ПЛР дозволяє виявляти збудника навіть при мінімальному його вмісті. Особливо це актуально при безсимптомному перебігу інфекційного процесу, викликаного безумовно-патогенними мікроорганізмами (гонорея, трихомоніаз, хламідійна інфекція). Наприклад, при хронічній гонореї у жінок навіть з допомогою бактеріологічного методу часто не вдається виявити гонокок, незважаючи на наявні симптоми хронічного запального процесу в шийці матки або уретрі.
ПЛР в діагностиці гепатитів
В даний час відомо як мінімум 5 вірусів, здатність яких викликати ураження печінки доведена. Це віруси гепатиту А, В, С, D, Е. У рідкісних випадках гепатит може бути викликаний вірусом Епштейна-Барр, вірусом простого герпесу. Здатність вражати печінку таких агентів як вірус ТТ, вірус гепатиту G сьогодні визнається не всіма. Всі перераховані вище віруси відносяться до різних сімейств, мають різні біологічні властивості і відповідно, тактика лікування буде теж значно відрізнятися в залежності від етіології гепатиту.
З огляду на вищевикладене, досить актуальною проблемою є адекватна причинний діагностика вірусних гепатитів, яка неможлива без використання сучасних молекулярно-біологічних методів, одним з яких є ПЛР.
Отже, в чому ж полягає гідність ПЛР в діагностиці гепатитів? Спробуємо розібратися:
1. Вірусний гепатит А (ВГА): ПЛР використовується для обстеження контактних осіб та більш раннього виявлення хворих гепатитом А в осередках інфекції (наприклад, в дитячому колективі), тому що РНК вірусу гепатиту А з'являється в крові хворого на гепатит А набагато раніше, ніж антитіла (anti-HAV IgM). І ще один важливий момент! Вважається, що через тиждень після появи клінічних симптомів, хворий на гепатит А перестає бути заразним. Але це стосується тільки фекально-орального шляху передачі вірусу. У крові хворого на гепатит А вірус присутній набагато довше (іноді до декількох місяців), тобто можливість зараження гепатитом А через кров не обмежується вищевказаними термінами, і ПЛР єдиний метод, за допомогою якого можливо здійснювати моніторинг вирусемии (наявності вірусу в крові).
2. Вірусний гепатит В (ВГВ): в діагностиці вірусного гепатиту В ПЛР має свої неоціненні переваги:
a. Якісне виявлення ДНК ВГВ:
- Рання діагностика гострого гепатиту В - ДНК вірусу гепатиту В починає виявлятися в крові хворого на гепатит В в середньому на 20 днів раніше, ніж HBsAg ( «Австралійський» антиген).
- Виявлення мутантних штамів вірусу гепатиту В.
- Виявлення прихованих форм вірусного гепатиту В.
b. Кількісна оцінка рівня ДНК HBV:
- Діагностика хронічного гепатиту В (вірусне навантаження більше 100000 є ознакою хронічного гепатиту В).
- Моніторинг активності вірусної реплікації у носіїв HBsAg.
- Контроль ефективності противірусної терапії.
c. Визначення YMDD мутації (стійкості вірусу гепатиту В до ламівудину) - в численних дослідженнях встановлено, що у ряду пацієнтів, що знаходяться на монотерапії зефіксом (ламівудином), можлива поява мутантного штаму вірусу, стійкого до препарату, тому актуальним завданням є раннє виявлення таких штамів для корекції схеми лікування.
3. Вірусний гепатит С (ВГС). Гепатит С рідко протікає з яскраво вираженими клінічними симптомами, частіше за все це випадкові знахідки під час лабораторного обстеження (виявлення anti-HCV IgG). З огляду на всю серйозність цього захворювання (часту хронизацию процесу (85%) і можливість розвитку цирозу печінки), стає зрозумілим, наскільки важлива лабораторна діагностика в рішенні цього питання. І саме ПЛР грає провідну роль в діагностиці гепатиту С дозволяючи:
a. Встановити факт інфікованості гепатитом С. По-перше, це важливо при обстеженні контактних осіб, тому що РНК ВГС з'являється в крові хворого на гепатит С набагато раніше ніж антитіла, які з'являються як мінімум через 2-3 місяці з моменту інфікування (період серологічного вікна). По-друге, визначення anti-HCV IgG методом ІФА в деяких випадках (часто у вагітних) дає «хибнопозитивні» результати, тому виявленні антитіл до вірусу гепатиту С, рекомендується підтверджувати якісним виявленням РНК, і в залежності від результатів ПЛР визначається тактика ведення пацієнта.
b. Встановити наявність показань до противірусного лікування, а також вибрати оптимальну схему лікування. Вирішити ці питання допомагають кількісне визначення рівня РНК ВГС (при низькому вірусному навантаженні ефективність лікування вище) і визначення генотипу ВГС (генотип 1 гірше відповідає на противірусну терапію в порівнянні з генотипами 2 і 3).
c. Своєчасно оцінити ефективність проведеного лікування. Так, найбільш ефективними препаратами для лікування хронічного гепатиту С на сьогоднішній день залишаються препарати інтерферону в комбінації з рибавірином. Курс лікування гепатиту С (генотип 1) становить 48 тижнів, але вже на 12 тижні лікування лікар може оцінити ефективність проведеної терапії, зіставляючи результати аналізів до початку лікування і на 12 тижні лікування.
d. Оцінити стійкість відповіді на лікування. Для цього проводять виявлення РНК ВГС після закінчення лікування, через 24 тижні і через 72 тижні після закінчення лікування.
ПЛР в діагностиці ВІЛ-інфекції
В даний час для лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції використовується найбільш доступний і одночасно чутливий підхід - виявлення в крові антитіл до ВІЛ за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) - anti-HIV з наступним підтвердженням позитивних результатів аналізу методом иммуноблоттинга (ІБ). Ефективність виявлення осіб, інфікованих ВІЛ, за допомогою даного підходу може досягати 99% і більше, що стало можливим завдяки розробці високочутливих і стандартизованих тест-систем для проведення ІФА та ІБ.
Однак наявність антитіл до ВІЛ у крові людини є лише непрямим маркером ВІЛ-інфекції, тому не дивно, що в деяких випадках сучасна методологія лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції може бути по суті неінформативної. Так, відомо, що в перші тижні після зараження антитіла до ВІЛ не можуть бути виявлені методом ІФА через їхню відсутність або низької концентрації (період серологічного "вікна", який в середньому займає від 2 до 6 місяців). Описано окремі випадки ВІЛ-інфекції, коли специфічні антитіла не виявлялися до 42 міс. з моменту інфікування. Крім того, у пацієнтів в термінальному періоді захворювання концентрація антитіл до ВІЛ може значно знижуватися, що теж призводить до хибнонегативних результатів ІФА та ІБ.
З іншого боку, відомо, що практично всі тест-системи для ІФА можуть давати хибнопозитивні результати. Пояснюють це явище присутністю в крові антитіл до антигенів, подібним з антигенами ВІЛ. Дана проблема вирішується шляхом додаткового аналізу всіх позитивних в ІФА сироваток методом ІБ. Однак при дослідженні таких зразків, а також сироваток, отриманих від ВІЛ-інфікованих пацієнтів під час сероконверсії (періоду ВІЛ-інфекції, коли починають вироблятися антитіла, але їх кількість ще не досить для виявлення), не вдається отримати однозначні результати ІБ. Згідно з рекомендаціями ВООЗ, сироватки, що дають сумнівні результати при застосуванні методу ІБ, повинні бути повторно досліджені з використанням наборів іншій серії або іншої фірми. У разі повторного сумнівного результату рекомендується спостереження за пацієнтом протягом 6 міс. і повторне дослідження сироваток через 3 міс. На практиці це призводить до значного подорожчання лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції, а також створює певні психологічні проблеми для осіб, які перебувають під таким наглядом.
Ефективність тестування на антитіла до ВІЛ знижується практично до нуля при обстеженні дітей, що народилися від ВІЛ-інфікованих матерів. Показано, що в крові у незаражених дітей, що народилися від ВІЛ-інфікованих матерів, антитіла до ВІЛ можуть виявлятися протягом тривалого часу після народження (до 1 року і більше). З іншого боку, зникнення антитіл до ВІЛ може бути викликано гіпоглобулінемія, що є наслідком викликаного ВІЛ імунодефіциту, і тому не може бути підставою для зняття діагнозу ВІЛ-інфекції. Тому такі діти повинні знаходитися під наглядом до 36 міс.
Перераховані вище проблеми імуноферментної діагностики ВІЛ-інфекції можуть бути вирішені за допомогою ПЛР.
Виявлення ВІЛ методом ПЛР в крові можливо в двох варіантах:
1. Виявлення ДНК провируса ВІЛ в мононуклеарних клітинах периферичної крові;
2. Виявлення РНК ВІЛ в біологічних рідинах організму (наприклад, в плазмі або сироватці крові).
Зараз ПЛР на ДНК провируса ВІЛ використовується як діагностична методика для прямої діагностики ВІЛ-інфекції в наступних випадках:
1. У період серологічного "вікна». Хоча слід пам'ятати! що чутливість ПЛР на провірусну ДНК ВІЛ коливається від 96 до 99%, в зв'язку з чим, не дивлячись на високі показники чутливості, ПЛР слід проводити або спільно з ІФА або з наступним підтвердженням ІФА;
2. У разі сумнівного результату ІБ;
3. При обстеженні дітей, що народилися від ВІЛ-інфікованих матерів. Використання ПЛР в цьому випадку дозволяє скоротити терміни постановки діагнозу ВІЛ-інфекції з 18 місяців до 3-6 місяців.
ПЛР на РНК ВІЛ використовується для кількісного виміру концентрації вірусу в крові з метою прогнозу і моніторингу вже встановленої ВІЛ-інфекції.
На закінчення необхідно відзначити, що вже на даному етапі розвитку ПЛР є найбільш чутливим та специфічним методом прямого виявлення збудників, що дозволяє не тільки встановлювати етіологію захворювання, а й здійснювати контроль за перебігом інфекційного процесу і оцінювати ефективність проведеної терапії. З огляду на все вищесказане, стає очевидним, що полімеразна ланцюгова реакція є необхідним і обов'язковим методом обстеження пацієнтів, і повинна знаходитися в арсеналі кожного лікаря, що займається інфекційною патологією.
Інформація надана Медичним центром здоров'я (м.Харків)
Медичний центр здоров'я єдиний на Східній Україні приватний медичний центр, який має в своєму арсеналі апарат для постановки ПЛР в режимі «Real Time». Діагностична лабораторія оснащена найсучаснішим лабораторно-діагностичним обладнанням, в центрі впроваджені інноваційні методики, комп'ютеризована система обробки і зберігання інформації, для постановки аналізів використовуються тільки оригінальні тест системи. Проводиться діагностика ендокринних патологій, інфекційних захворювань, імунологічного статусу організму, виявлення онкологічних захворювань на ранніх стадіях, бактеріологічне дослідження біоматеріалу, клінічні та біохімічні аналізи.
Лабораторія відповідає всім стандартам Міністерства Охорони здоров'я України
Медичний центр здоров'я активно співпрацює з Центральними районними лікарнями Харківської області, підключаючи свої відділення до єдиної IT-системі, що дозволяє швидко і якісно проводити дослідження, надавати точні результати аналізів «на місця» в стислі терміни. Запрошує до співпраці прогресивно мислячих лікарів:
Ви маєте можливість за телефоном або через сайт (зворотний зв'язок) відправити заявку на проведення для Вас індивідуальної презентації обладнання та методики дослідження за методом ПЛР.
докладніше
